ELISAにおけるサンプルのマトリックス効果とその対策
マトリックスとは、標的分析物以外のサンプル中のすべての成分を指し、サンプルマトリックス中のタンパク質、脂質、塩類、色素、小分子有機物などが含まれます。マトリックス効果とは、これらのマトリックス成分が標的分析物または分析システムと相互作用し、標的分析物の分離、抽出または検出応答を妨害し、最終的に分析結果を真の値から逸脱させる現象です。この種の妨害は、血清、血漿、脳脊髄液、組織ホモジネート、細胞培養培地などの生物学的サンプルに広く存在し、ELISA実験における再現性の悪さや定量の不正確さの一般的な原因です。
I. サンプルマトリックス効果のメカニズム
1. 結合部位への直接競合結合：マトリックス中の特定のタンパク質または小分子は、抗体の抗原結合部位に非特異的に結合するか、標的抗原と競合して抗体に結合する可能性があり、その結果、検出シグナルの阻害または増強が生じます。
2. 反応環境への影響：マトリックス中のイオン、pH緩衝物質、脂質などの成分は、反応系のpH値、浸透圧、または粘度を変化させる可能性があります。これにより、抗原-抗体結合の効率が影響を受けるか、酵素触媒反応が妨害されます。
3. シグナル検出への妨害：マトリックス中の有色物質、蛍光物質、または酵素阻害剤は、シグナルの読み取りを直接妨害し、シグナル値の歪みを引き起こす可能性があります。
4. 物理吸着妨害：マトリックス中の高分子は、マイクロプレートの表面に非特異的に吸着するか、検出抗体または酵素コンジュゲートに結合する可能性があります。これによりバックグラウンドシグナルが増加し、真の標的シグナルがマスクされます。
Ⅱ. マトリックス効果の評価方法
マトリックス効果の程度を判断するには、実験的な検証が必要です。一般的な方法は以下の通りです：
1. 抽出後スパイキング法：この方法は、純粋な溶液中の分析物の応答とブランクマトリックス中の分析物の応答を比較することによって、マトリックス効果を評価します。ブランクマトリックスは、サンプルを前処理することによって得られ、標的分析物を含まず、元のサンプルのマトリックス成分を保持しています。
2. 相対応答値法：この方法は、純溶媒中の分析物の応答値と、サンプルマトリックスにスパイクされた（同濃度の）分析物の応答値を比較することによって、マトリックス効果を評価します。2つの応答値に差がある場合、マトリックス効果の存在を示します。差が大きいほど、マトリックス効果は顕著です。
3. 検量線決定法：サンプルブランク、試薬ブランク、標準溶液ブランクをマトリックスとしてそれぞれ検量線を作成します。これらの検量線の直線の傾きを比較することによって、マトリックス効果の程度を評価します。傾きに差がある場合、マトリックスが分析物の応答に影響を及ぼしていることを示唆します。
4. 回収実験：既知濃度の標準標的抗原を異なる希釈倍率のマトリックスサンプルに添加し、実際の検出値と理論値の比率を計算します。回収率が80％から120％の範囲から逸脱した場合、顕著なマトリックス効果が存在することを示します。
III. マトリックス効果に対する主な対策
1. サンプル前処理の最適化
希釈法：サンプルを適切に希釈することにより、マトリックス成分の濃度を低下させ、反応への干渉を最小限に抑えます。ただし、2点に注意する必要があります。過剰な希釈は、標的分析物濃度が検出限界を下回ることを防ぐために回避する必要があります。また、希釈後にマトリックス効果が大幅に低減されたかどうかを確認する必要があります。
抽出と精製：固相抽出（SPE）、QuEChERS（Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe）、遠心限外ろ過、窒素ブローダウンなどの方法を使用して、標的分析物を妨害性マトリックス成分から分離します。このアプローチは、複雑なマトリックスに特に適しています。
脱脂/除タンパク質：高タンパク質・高脂質サンプル（血液、肉など）の場合、沈殿、遠心分離、凍結脱脂などの方法によって主要な妨害性マトリックス成分を除去することができます。
誘導体化：標的分析物を誘導体化して、分析物とマトリックス成分の間の物理化学的性質の差を増加させ、それによってそれらの相互作用を減らします。
2. 反応系とキット設計の改善
バッファー処方の最適化：反応バッファーにブロッキング剤または競合阻害剤を添加して、マトリックス成分と抗体の間の非特異的結合をブロックします。また、酵素安定剤を組み込んで、マトリックスが酵素活性に与える影響を減らします。
高特異性抗体の選択：モノクローナル抗体またはスクリーニングされたポリクローナル抗体を使用して、マトリックス成分との交差反応性を低減します。また、抗体工学によって改変された組換え抗体を適用して、抗体の標的抗原に対する選択性を高めることもできます。
検出モードの改善：例えば、従来の「ワンステップ法」を「段階的インキュベーション法」に置き換えます。具体的には、サンプルを最初に捕捉抗体と完全に結合させ、洗浄後に検出抗体を添加します。この改変により、マトリックスと検出抗体の間の競合的結合が減少します。
3. マトリックスマッチングと標準化
マトリックスマッチした標準液の使用：標的分析物を含まない同じタイプのマトリックス（例：正常血清）で標準液を希釈し、標準液のマトリックス環境がサンプルのマトリックス環境と一致するようにします。これにより、マトリックスの違いによるシグナルの偏差が減少します。例えば、ヒト血清サンプルを検出する場合、標準液は単純なPBSバッファーではなく「ヒト血清マトリックス希釈液」で希釈する必要があります。
マトリックス補正モデルの確立：数学的アルゴリズム（加重回帰や部分最小二乗回帰など）を使用して、マトリックス効果によるシグナルの偏差を補正します。このアプローチは、バッチサンプルのテストや自動分析システムに特に適しています。
4. 内部標準法（特に同位体内部標準）
標的分析物と物理化学的性質が類似した内部標準物質を選択し、内部標準とサンプルを同時に前処理および検出します。「標的分析物応答値/内部標準応答値」の比率を計算して定量を行い、マトリックスが標的分析物と内部標準の両方に及ぼす同時の妨害を相殺することができます。
マトリックス効果の本質は、マトリックス成分と分析システムの間の相互干渉にあります。この問題に対処するには、サンプルの特性と分析方法に基づいて戦略を総合的に選択する必要があります。実際の作業では、「前処理精製 + マトリックスマッチ較正 + 内部標準法」の組み合わせアプローチが、マトリックス効果の結果への影響を最小限に抑えるためによく採用されています。
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