Q1：培養細胞を過剰に増殖させた場合、何らかの処理なしで培地だけを交換してよいのでしょうか？
A1：動物細胞の培養において、フラスコ内での培養を行うと、接触増殖および接触抑制という特性を示します。細胞がフラスコの表面全体を覆うようになると、それ以上増殖は起こらなくなり、2 層に成長する現象も起きません。この時点で培養フラスコや培地を交換する必要があります。そうでなければ細胞の増殖が止まってしまいます。がん細胞はこの制限から自由であり、接触抑制に達しても無限に増殖し続けることができます。
Q2：なぜ細胞培養培地が黄色くなるのでしょうか？また、それは細胞の状態に影響しますか？
A2：培地が黄色くなるのは、細胞が活発に増殖し代謝が行われるため、大量の乳酸およびCO2が生産され、これが培地の pH 値に影響を与えるからです。さらに、細胞は培地内の大部分の栄養を吸収し、二次代謝産物が徐々に増加して環境が次第に適さなくなるためです。このような場合は、新しい培地で交換する必要があります。
Q3：細胞に対して新しい培地や血清をどのように交換しますか？
A3：考えられる理由：
(1) 血清は天然産物であるため、ロットごとのばらつきがあります！血清のブランドやロット番号を突然変更すると、細胞が適応できずに死んでしまう可能性があります。推奨事項：血清を交換する前に、まずサンプルでテストを行ってください。交換する際は、古いバッチと新しいバッチの血清をそれぞれに培養媒体に分けて準備し、一定の割合で混合して細胞が適応した後に交換を完了させます。同時に、培養結果が良いロットを一度に多く購入し、後続の実験における安定した細胞培養条件を保証します。
(2) 細胞に対して新しい培地を交換する方法？ある特定の細胞型に最適な媒体がない場合、まず元の条件下で一部の細胞を凍結保存し、その後段階的に新しい培地の割合を増やします：25%、50%、75% から 100% にし、3-5 回継代後に細胞が適応するようにします。
Q4：培地中のグルタミンの役割は何ですか？
A4：ほぼすべての細胞はグルタミンに対して高い要求があります。細胞はタンパク質を合成するためにグルタミンが必要です。グルタミンが不足すると、細胞の増殖が悪化し死に至ります。したがって、各種培養媒体には大量のグルタミンが含まれています。ここが重要な点ですが、グルタミンをどのように使用するかです。グルタミンは溶液中で非常に不安定であり、-20°C で保存し、使用前に培地に添加する必要があります。4°C の冷蔵庫でグルタミンを含む培地を 2 週間以上保管すると、元の量のグルタミンを再度追加する必要があるでしょう。正しく使用すれば、通常は追加補充は不要です（例：光を遮断して 4°C で保存、分注し、繰り返し事前に温めすぎないなど）。
Q5：細胞培養における培地の色変化は何を表していますか？
A5：培地の色は主にフェノールレッドに由来しており、pH の範囲が 6-8 で黄から紫赤に変化する非常に敏感な色インジケーターです。培養観察を容易にするため、フェノールレッドは培養媒体の状態を直感的に把握できるようになります。もし培地が酸性であればより黄色く、アルカリ性であればより紫色に見えます。一般的に、細菌汚染があった場合や長期間培地を交換していなかった場合、培地は黄色くなります。これは主に細菌や細胞の過剰増殖により酸性物質が生産されるためです。4°C の冷蔵庫で開封した培気を保管している場合、培地中の二酸化炭素が徐々に逸散し、pH がアルカリ性に傾くため、培地はより紫色に見えます。
紫の培地については、無菌濾過した二酸化炭素を吹き込み、pH 値を調整した後で引き続き使用できます。長期間未使用のアルカリ性培地使用は推奨されません。細胞増殖の停止や死を引き起こす可能性があるためです。
細胞培養における培地の pH 値は実験結果に大きな影響を与えます。培地の pH 値は、直接または間接的に栄養吸収、呼吸代謝、ポリアミン代謝、DNA 合成、植物ホルモン輸送（細胞内への出入り）に影響するため、カルス形成や形態形成にも影響を及ぼします。pH 値が 6.5 より大きい場合、高温高圧滅菌の際に色反応が起こります。pH 値が 6.8 の場合は色の定性変化が生じます。一般的に、滅菌時間および圧力は培地の色に影響を与えません。
Q6：細胞培養において注意すべき事項は何ですか？
(1) 細胞培養培地には NaHCO3 を添加する必要がある。これは溶液の pH を安定させる機能を持つ。
(2) 培地色の変化を指標として培地交換に用いることは十分ではないが、実用的である。なぜなら培養媒体中にインジケーターとなるフェノールレッドが存在するため、液の色変化は細胞の成長状態を間接的に示すことができるからである。細胞が活発に増殖して酸を生産すると、液は黄色く見える；逆に、紫色赤に見える。
(3) 細胞を観察する際、液中の pH が大きく変化すると細胞に害を与え、細胞増殖に不利である。
Q7：なぜ多くの細胞培養に 5% の CO2を使用するのか？
A7：細胞培養で使用されるインキュベーターは一般に CO2 インキュベータと呼ばれ、ガス環境は 95% の空気および 5% の CO2 です。CO2 は細胞の代謝産物であると同時に、細胞が必要とする成分でもあります。これは主に培養媒体の pH を維持する点と直接関係しています。多くの動物細胞は、pH が 7.2-7.4 のわずかにアルカリ性の環境を必要とし、好ましくは 6.8-7.6 を超えないことです。細胞培養中、CO2 の放出が増加すると培地が酸性化するため、NaHCO3 が通常添加されます（水中に溶解した CO2 から生成される H2CO3 と緩衝対を形成して pH を調整）. NaHCO3 は CO2 を放出する傾向があり、CO2 を添加することでこの反応を抑制します。インキュベーター中の CO2 濃度は培地中の NaHCO3 濃度とバランスする必要があります。インキュベーター中の CO2 濃度が高すぎると pH が低下し、低すぎると pH が上昇します。
Q8：すべての細胞培養媒体が同じ CO2 濃度を必要とするのか？
A8：そうとは限りません。CO2 濃度は NaHCO3 濃度に依存します。溶液中の CO2 と HCO3-は緩衝系を形成し、哺乳類細胞の増殖に最適な弱アルカリ性の pH（約 7）を維持します。培地が長時間空気中に曝露されると、HCO3-は急速に分解して pH が急激に上昇し、視覚的には赤から紫色に変化します。培地を細胞培養インキュベーターに戻すと、CO2 の作用により徐々に紫から再び赤に戻ります。
異なる細胞培養媒体には異なる NaHCO3 濃度があるため、各細胞培養媒体に対応する CO2 濃度を選択する必要があります：
NaHCO3(g/L) 濃度が<1.5の場合、必要な CO2 濃度は4%
NaHCO3(g/L) 濃度が1.5-2.2の間の場合、必要な CO2 濃度は5%
NaHCO3(g/L) 濃度が2.2-3.4の間の場合、必要な CO2 濃度は7%
NaHCO3(g/L) が>3.5の場合、必要な CO2 濃度は10%
Q9：細胞が継続的に増殖すると、pH 値は徐々に低下します（乳酸の代謝蓄積による）。培養過程で培地の pH が異常に変化しているのを発見した时应て何をするべきですか？
A9：対応方法
(1) CO2濃度が適切か確認する：培地中の炭酸ナトリウム濃度に基づいてインキュベーター内の CO2 パーセントを調整します。炭酸ナトリウム濃度が 2.0-3.7 g/L の場合、それぞれ 5-10% の CO2 を使用するか、または CO2 非依存培地への切り替えを検討します。
(2) 培養フラスコのカップがきつく閉じられていないか確認する：1/4 ターンほどカップを緩めます。
(3) 炭酸水素塩緩衝が不足していないか確認する：HEPES 緩衝液を最終濃度 10-25 mM に添加します。
(4) 培地中に誤った塩が含まれていないか確認する：CO2 条件下では Earle's salt medium を使用し、大気条件では Hanks' salt medium を使用します。
(5) 細菌、酵母、または真菌汚染があるか確認する：培養と培地を廃棄し、可能であれば脱汚染を試みます。
Q10：なぜ DMEM 培地は明るい赤色をしているのか？
A10：培地の色は主にフェノールレッドで示されており、pH の範囲が 6-8 で黄から紫赤に変化する非常に敏感な色インジケーターです。フェノールレッドは必須ではなく、場合によっては冗長であることもあります。フェノールレッドはステロイドホルモンに似た効果を持つため、ステロイドホルモン関連の研究を含む細胞培養では添加しないことが望ましいです。しかし、培養観察を容易にするため、フェノールレッドは培地状態を直感的に把握できるようになります。もし培地が酸性であれば黄色く、アルカリ性であれば紫色に見えます。
Q11：CO2 が含まれていないインキュベーターに培養皿を置いた場合、なぜ培地が紫色になるのか？
A11：一般的な DMEM で使用される緩衝系は NaHCO3: 2NaHCO3=Na2CO3+CO2+H2O です。CO2 が含まれないインキュベーターでは、培地中の CO2 が継続的に逸散し、炭酸が減って溶液がアルカリ性化するため、紫色になります。同様に、長期間開封した DMEM ボールの培地も、同じ理由により徐々に紫色になります。
Q12：紫色の培地も使用できますか？
A12：紫色の培地をキャップを緩めた CO2 インキュベーターに置くことができます。しばらくすると色が鮮やかな赤に変化し、その後継続的に使用できます。ただし、長期間未使用で色が変わった培地使用は推奨されません。空気中の酸化によって媒体成分が変化している可能性があるためです。細胞培養中、培地の色と透明度の変化を確認します。黄色い色は pH の低下を示し、赤または紫赤は pH の増加、細胞増殖の停止、または死を示します。一般的に、安定した成長をしている細胞については 2-3 日ごとに培地を交換するべきであり、ゆっくり増殖する細胞については 3-4 日ごとに変換します。
Q13：培地汚染を防ぐにはどうすればよいか？
A13：解決策
(1) 使用前および使用后、75% エタノールで培地および他の試薬瓶の外表面を消毒する。また、試薬瓶の開口部を長期間露出させないようにする。
(2) 培地および他の必要な試薬を可能な限り分注する。操作中に誤りが発生した場合、再度使用しないことが望ましい。
(3) 培地を扱う際は、使い捨て無菌プラスチックまたはガラスピペットを使用する。各ピペットは一度限り使用して交叉汚染を防ぐ。
(4) 毎日顕微鏡で細胞を観察し、培地の濁度に注意を払う。
(5) 培地および他の試薬を他人と共有しない。
(6) 各細胞型ごとに 1 つの培地瓶を使用する。これにより交叉汚染を効果的に回避できる。
(7) 一度に 1 つの細胞型しか扱わない。これにより細胞間の交叉汚染を防ぐ。