二次抗体を選択する際には、以下の点が役立ちます：

1. 一次抗体の宿主種を確認してください、つまり二次抗体が反応する種（例：ウサギ抗MS2モノクローナル抗体の場合、一次抗体の宿主はウサギです）。

2. 二次抗体に適した宿主種を選択してください（例：ヤギ抗マウスIgG、ここで二次抗体の宿主はヤギです）。

3. 二次抗体の交差反応性または特異性、および交差吸収されているかどうかを考慮してください。
4. 多重標識アプリケーションで使用されるか、またはサンプルに内因性抗体が含まれているかどうかを考慮してください。
5. 特異性：一次抗体のクラスまたはフラグメントに正しく結合していることを確認してください。
6. 検出方法に応じて適切なコンジュゲートを選択してください。

二次抗体は、一次抗体の種に対して産生されます。したがって、一次抗体の宿主種とは異なる種で飼育された二次抗体が必要です。例えば、一次抗体がウサギで飼育されている場合、ウサギ以外の宿主種で飼育された抗ウサギ二次抗体が必要になります（例：ヤギ、マウスなど）。

推奨される抗体希釈倍率/濃度の値は、一部は抗体開発プロセスの実験から得られたものであり、一部は協力している機関や他のお客様の経験に基づいています。サンプルや実験条件の違いにより、特定の実験で最適に機能しない場合があります。推奨値が適切でない場合は、いくつかの異なる希釈倍率/濃度を試してみてください。

ヤギ抗マウスIgG (H+L) は複数のクラスが存在し、IgGとIgM抗体の間にはいくつかの配列類似性があります。したがって、交差吸収されていないヤギ抗マウスIgG (H+L) は、マウスIgM抗体とある程度の交差反応性を示す可能性があります。IgM抗体と完全に交差反応しない必要がある場合は、ヤギ抗マウスIgG1、ヤギ抗マウスIgG2a、ヤギ抗マウスIgG2bなどの抗体を選択することができます。

ヤギ抗マウスIgG (H+L) は、IgG3を含むすべてのマウスIgGサブクラスに結合します。

この抗体はラットIgGに対して交差吸収されておらず、この点に関する詳細な情報はありません。ただし、当該抗体がポリクローナル抗体であることを考慮すると、この可能性を除外することはできません。

ヤギ抗マウスIgG (H+L) の免疫原には重鎖と軽鎖の両方が含まれています。軽鎖はカッパまたはラムダです。したがって、この抗体はカッパ鎖を持つ一次抗体と反応しますが、カッパ鎖に特異的ではありません。

2つの異なるコンジュゲートで標識された抗体は、同じサンプル上でクロモゲン染色と蛍光染色の両方の画像化を可能にします。したがって、マルチモーダル研究が可能であり、この目的のために特別な標識を提供することができます。

二次抗体は一次抗体に結合します。したがって、二次抗体の適用範囲は一次抗体とより密接に関連しています。一次抗体が特定の免疫学的検査で使用できる場合、二次抗体も通常使用できます。結果として、最終的な適用範囲は主に一次抗体の適用範囲、二次抗体の標識の種類、およびシグナル出力システムに依存します。

すべての蛍光色素は、吸収波長の強い光に曝露されると、ある程度褪色するか、「光褪色」を起こします。潜在的な解決策は以下の通りです：

1. Fluor色素などのより光安定な色素を選択してください。
2. 対比染色と画像領域を柔軟に調整した後、ターゲット染色に移行して画像化してください。
3. レーザーパワーを下げたり、中性密度フィルターを使用したりすることで、サンプルの曝露時間と強度を減らしてください。
4. 標識されたサンプルの観察時間を可能な限り短くし、画像化していないときはシャッターを閉じてください。
5. 低倍率対物レンズなど、数値開口の小さい対物レンズを使用してください。

古典的なELISAシステムは、通常、捕捉抗体と検出抗体を含むサンドイッチアッセイ形式を使用します。両方の抗体がマウスモノクローナル抗体である場合、HRP標識ヤギ抗マウスIgGは両方に結合して、アッセイを非特異的にしてしまいます。したがって、ELISAシステムでは、捕捉抗体の宿主種はマウスであってはならず、検出抗体はマウス由来でなければなりません。さらに、検出されるサンプル種にはマウスIgGまたは類似の分子が存在してはなりません。

多色免疫蛍光のために、異なる蛍光色素でコンジュゲートされた二次抗体を使用することは可能ですが、注意深い設計と考慮が必要です：

1. 蛍光色素の選択：励起および発光スペクトルができるだけ分離している蛍光色素を選択してください。スペクトルの重なりが少ないほど、クロストーク（チャネル漏れ）の可能性が減ります。広く分離された発光ピークを持つ色素の組み合わせを優先してください（例：Fluor488、Fluor555、Fluor647の組み合わせは非常に古典的です）。
2. 装置の互換性：選択した蛍光色素が、実験室の顕微鏡または画像取得システムのレーザーおよびフィルターセットによって効果的に励起され、検出されることを確認してください。色素を選択する前に装置の設定ガイドを参照してください。
3. 明るさと発現レベルのマッチング：最も明るい蛍光色素（例：Fluor647、Cy5）を低存在量の標的タンパク質に割り当ててください。より暗い蛍光色素（例：FITC、Cy2）を高存在量の標的タンパク質に割り当ててください。これは、チャネル間の信号強度を平衡させるのに役立ち、強い信号が弱い信号をマスクするのを防ぎます。
4. 二次抗体の特異性と交差吸収：これは、非特異的な交差反応性を防止するために非常に重要であり、結果の信頼性に直接影響します。交差吸収された二次抗体を選択する必要があります。これは、抗体が他の種の免疫グロブリンと交差反応する可能性のある抗体を除去するために精製されていることを意味します。例えば、マウスとラットの両方の一次抗体を使用する場合、抗マウス二次抗体はラット血清タンパク質に対して交差吸収されている必要があり、その逆もまた然りです。これにより、二次抗体が標的とする一次抗体のみに結合し、他の種の一次抗体と交差反応しないことが保証されます。
5. 宿主種：すべての二次抗体は同じ宿主種から得られなければなりません（例：すべてヤギ由来）。これは、二次抗体が互いを認識して結合するのを防ぎます（例：抗ウサギ二次抗体が誤って抗マウス二次抗体と結合する）、これにより偽陽性の結果が生じます。
6. 実験設計とコントロール：適切なコントロールなしでは、多色実験の結果を解釈することは困難です。単色コントロールが不可欠です。各実験では、1つの一次/二次抗体対のみで染色されたサンプルを含め、他のチャネルは二次抗体希釈液のみ（または一次抗体なし）を使用してください。これらのコントロールは、実際の画像取得条件で各チャネルのクロストークをチェックするために使用されます。ブランクコントロール：すべての一次抗体をスキップし、二次抗体混合物のみでインキュベートして、二次抗体の非特異的結合を検出してください。順次インキュベーション：異なる種の一次抗体を最初に別々にインキュベートし、次に対応する種特異的二次抗体を混合物としてインキュベートすることが推奨されます。これは、すべての一次抗体を混合し、次にすべての二次抗体を混合することと比較して、交差反応のリスクを低減する可能性があります。
7. 抗体濃度の最適化（滴定）：使用する前に、各抗体対を滴定して、最高のシグナルノイズ比を与える最適な濃度を見つけてください。過度に高い抗体濃度は、バックグラウンドと非特異的結合を増加させます。
8. 画像取得と処理：うまく実行された実験でも、不適切な画像取得は結果を台無しにする可能性があります。すべてのチャネルが同時に励起および取得されるのを防いでください。取得シーケンスを、各チャネルを個別に（順次）励起してキャプチャするように設定してください。これにより、取得中のチャネル間のクロストークが完全に排除されます。スペクトル分離：装置にこの機能がある場合（例：一部の共焦点顕微鏡）、非常に重なったスペクトルを持つ蛍光信号を効果的に分離することができ、多色実験の強力なツールです。後処理：小さなクロストークが検出された場合、ソフトウェアはスペクトル分離計算に使用される場合がありますが、最良のアプローチは実験設計段階でクロストークを防ぐことです。