TIME解析のためのTSA-mIF

TIME 解析のための TSA-mIF

背景

癌とホスト免疫系の相互作用は、主に腫瘍を取り囲む反応性組織間質（Tumor Immune Microenvironment (TIME)）で起こります。免疫チェックポイント阻害剤の画期的な臨床応用、特にプログラムデスプロテイン 1（PD-1、T 細胞共抑制受容体）およびプログラムデスリガンド 1（PD-L1、B7-H1/CD274 としても知られる）に対する標的療法は、癌免疫療法の新たな時代を加速させるだけでなく、TIME の機能的解析を研究および臨床の場における核心的な焦点にしました。TIME の細胞構成、機能状態、分子相互作用ネットワークの精密な特徴付けは、免疫療法の応答予測バイオマスクリーニングのための不可欠な前提条件です。さらに、TIME 内の各種免疫細胞の二重のプロ癌/抗癌メカニズムを深く解明し、それらが腫瘍細胞との動的な関連性を明らかにすることは、新たな免疫治療戦略の開発にとって核心的な支援となります。しかし、TIME の高い不均一性と低アブアンダンス免疫分子検出の課題は、従来の解析技術に重大な制約を課しており、このジレンマを克服するために高度に感度が高く、多重標的を用いた in situ 検出工具の緊急要請が生じています。

                                                                               腫瘍微小環境 (TME)^[1]

利点

百年以上にわたって、ヘマトキシリン - イオシン染色（HE 染色）は、病理学者が顕微鏡観察下で生検および手術標本内のリンパ球、癌細胞核、腺体、および他の組織構造を観察するための古典的な手法です。その形態学的特徴は疾病のグレード付けおよび診断のための重要な証拠を提供します。免疫組織化学（IHC）はエストロゲン受容体やヒト上皮成長因子受容体 2 などの臨床マーカーを分析するルーチン手法ですが、TIME 研究において両者は明らかな制限を持っています？HE 染色では免疫細胞サブセットおよび機能分子を正確に識別できず、標準的な IHC はセクションあたり 1 つのマーカーのみを検出できるため、TIME の多細胞相互作用および分子ネットワークの複雑な特徴を捉えることが困難です。近年、タイラミド信号増幅（TSA）の原理に基づく多重免疫蛍光技術（mIF）はこのジレンマを完全に克服しました。「単一マーカー抗体標識 - 過酸化還元酵素（HRP）によるフッ素結合型タイラミド分子の共有結合標的エピトープへの触媒 - 複数回反復染色のための抗体エリジョン」という核心的戦略に、マルチスペクトルイメージング顕微鏡走査と AI イメージ解析を組み合わせることで、この技術は単一組織セクション上で 5-10 つのマーカーの同時検出が可能になります。これにより、CD8?T 細胞、調節性 T 細胞、腫瘍関連マクロファージなどの免疫サブセットを正確に識別し、低アブアンダンス免疫チェックポイント分子（PD-1/PD-L1 など）の高感度検出を実現するだけでなく、in situ 組織構造を完全に保存したまま、細胞間の空間的近接関係および相互作用パターンを定量化できます。これにより、従来の技術では困難な「細胞分類 - 機能フェノタイプ - 空間分布」という多次元情報の同時取得という問題を解決し、TIME の免疫抑制メカニズムの解析、免疫療法の応答バイオマスクリーニング、そして三次リンパ構造（TLS）などの主要機能領域の発見に強い技術的支援を提供します。これが腫瘍免疫学研究および精密診断治療変革の中核となるツールとなっています。

ケース

TSA ベースの多重免疫蛍光技術を用いて、Maltseva et al.は、免疫療法の応答者と非応答者群の患者における TIME の免疫細胞構成および PD-1 発現特性を体系的に分析しました。この研究では inForm ฟีノタイプ解析ソフトウェアを用いて細胞の精密な識別と分類を実現し、データ分析の客観性と効率性を確保しました。実験は CD8、PD-1、CD20、CD163、および FoxP3 抗体を含む標的抗体パネルを選択し、それぞれシトキシック T リンパ球、免疫チェックポイント分子、B リンパ球、プロ癌型マクロファージ、調節性 T 細胞を対象としました。核は DAPI で染色され、蛍光消去防止の封入剤で処理して信号安定性を維持しました。定量解析フェーズでは、200 倍拡大下で 10 つの代表視野を選択し、腫瘍節内（腫瘍細胞周囲間質および三次リンパ構造を除く）における全間質細胞内の上記免疫細胞の割合を計算しました。マルチカラー標識（CD8?細胞緑色、CD20?細胞黄色、CD163?細胞赤色、Treg 細胞オレンジ色、PD-1 発現白色、核青色）を通じて、細胞浸潤パターンを視覚的に提示しました。同時に、inForm ソフトウェアを用いて単一マーカーデータを免疫組織化学シミュレーションマップに変換し、結果の解釈をさらに支援しました。TSA 技術の高感度および多重検出の利点を通じて、この研究は異なる治療応答群間の TIME 免疫景観の違いを明確に明らかにし、免疫療法応答バイオマスクリーニングのための直接的な実験的証拠を提供するとともに、臨床標本における TIME の深層解析における TSA 多重免疫蛍光技術の中核的な応用価値を確認しました。

Figure 1 CD8 シトキシックリンパ球、CD20 B リンパ球、FoxP3 調節性 T 細胞および CD163 マクロファージの腫瘍浸潤パターン（A）と非応答者（B）^[2]。

非小細胞肺癌（NSCLC）の腫瘍微小環境に関する研究において、Peng et al.は多重免疫蛍光技術を用いて腫瘍巣（TN）および腫瘍間質（TS）内の 10 つの免疫マーカーの発現特性および相互作用関係を体系的に分析しました。結果として、TIME 内には複数の強い相関性免疫細胞相互作用が確認されました：間質 CD20⁺B 細胞と間質 CD4?CD38?T 細胞、中性好球細胞と FOXP3⁺細胞、間質中性好球細胞と腫瘍内調節性 T 細胞、腫瘍内 CD38⁺T 細胞と腫瘍内 CD20⁺B 細胞、腫瘍内 CD8⁺T 細胞と腫瘍内 PD-L1 発現 M2 マクロファージ、および腫瘍内 PD-L1⁺細胞と腫瘍内 CD8⁺T 細胞です。さらに、この研究では腫瘍内 CD133⁺細胞と腫瘍内 M1 マクロファージ（特に PD-L1 を発現しない M1 マクロファージ）との間にある中等度の相関を発見しました。これは、腫瘍内マクロファージが CD8?T 細胞の枯渇型免疫反応を媒介する役割を果たす可能性があることを示唆しています。多重検出の利点を持つ多重免疫蛍光技術を通じて、この研究は NSCLC の TIME 免疫景観および細胞相互作用ネットワークを明確に概説し、後のメカニズム探求および治療標スクリーニングのための重要な参照を提供しました。

Figure 2 非小細胞肺癌における 10 つの免疫マーカーの発現プロファイル。図は個別および統合された免疫蛍光画像、ならびに病理切片^[3]を示しています。

組織マイクロアレイ（TMA）研究において、Mori et al.は最適化された多重免疫蛍光プロトコル（IP1 および IP2）を用いて気管支気道腫瘍および乳がん TMA サンプルを染色しました。マルチスペクトル画像のアンミキシングおよび解析は inForm ソフトウェアにより完了し、「病理学的ビュー」を生成して DAB 染色にシミュレーションすることで結果解釈を支援しました。その中で、IP1 プロトコルでは TME 内で同時に 5 つの細胞種（CD3?T 細胞、CD20?B 細胞、CD3?FOXP3?調節性 T 細胞、CD117?CK?好酸球、CK?上皮/腫瘍細胞）を同時に識別できます。Ki67 染色と組み合わせて細胞増殖状態を評価し、CD117 と CK の共局在を通じて異なる細胞サブセットを区別できます。IP2 プロトコルは 4 つの主要な細胞種（CD3?CD8?T 細胞、CD3?CD8?シトキシック T 細胞、CD68?マクロファージ、CK?上皮/腫瘍細胞）に焦点を当てており、PD-1/PD-L1 免疫チェックポイント分子の検出を組み込み、乳がんサンプルにおける PD-L1?CD68?マクロファージおよび PD-1?T 細胞の共局在特性を成功裏に捕捉しました。標準化された mIF プロトコルと TMA 技術の組み合わせを通じて、この研究は多種類の腫瘍標本における TME 細胞構成、機能状態、および免疫分子相互作用の体系的な分析を効率的に達成し、ハイスループット臨床標本 TIME 研究のための実行可能な経路を提供しました。

Figure 3 人間気管支気道生検組織マイクロアレイを二つの多重免疫蛍光プロトコル、IP1 (a) および IP2 (b)^[4]で染色した。

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参考文献

1. Rojas F, Hernandez S, Lazcano R, Laberiano-Fernandez C, Parra ER. Multiplex Immunofluorescence and the Digital Image Analysis Workflow for Evaluation of the Tumor Immune Environment in Translational Research. Front Oncol. 2022 Jun 27;12:889886. doi: 10.3389/fonc.2022.889886. PMID: 35832550; PMCID: PMC9271766.

2. Maltseva A, Kalinchuk A, Chernorubashkina N, Sisakyan V, Lots I, Gofman A, Anzhiganova Y, Martynova E, Zukov R, Aleksandrova E, Kolomiets L, Tashireva L. Predicting Response to Immunotargeted Therapy in Endometrial Cancer via Tumor Immune Microenvironment: A Multicenter, Observational Study. Int J Mol Sci. 2024 Apr 1;25(7):3933. doi: 10.3390/ijms25073933. PMID: 38612743; PMCID: PMC11011874.

3. Peng H, Wu X, Zhong R, Yu T, Cai X, Liu J, Wen Y, Ao Y, Chen J, Li Y, He M, Li C, Zheng H, Chen Y, Pan Z, He J, Liang W. Profiling Tumor Immune Microenvironment of Non-Small Cell Lung Cancer Using Multiplex Immunofluorescence. Front Immunol. 2021 Nov 4;12:750046. doi: 10.3389/fimmu.2021.750046. PMID: 34804034; PMCID: PMC8600321.

4. Mori H, Bolen J, Schuetter L, Massion P, Hoyt CC, VandenBerg S, Esserman L, Borowsky AD, Campbell MJ. Characterizing the Tumor Immune Microenvironment with Tyramide-Based Multiplex Immunofluorescence. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2020 Dec;25(4):417-432. doi: 10.1007/s10911-021-09479-2. Epub 2021 Feb 15. PMID: 33590360; PMCID: PMC7960613.