ハイブリドーマ細胞スクリーニングの原理と方法

ハイブリドーマ細胞スクリーニングの原理と方法

モノクローナル抗体の製備において、2 つのスクリーニング工程が存在します。第 1 の工程はハイブリドーマ細胞を選別すること、第 2 の工程は特定の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をさらに選別することです。

第 1 のスクリーニング

B 細胞と腫瘍細胞の融合においては、未融合 B 細胞、未融合腫瘍細胞、「B 細胞-B 細胞」融合細胞、「腫瘍細胞-腫瘍細胞」融合細胞、「B 細胞-腫瘍細胞」融合細胞など、さまざまな種類の細胞が存在します。当社の目的は、B 細胞と腫瘍細胞の融合によって形成されたハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることです。ハイブリドーマ細胞の選択培養が第 1 回スクリーニングの鍵であり、この目的のために HAT 選択培地が一般的に使用されます。

HAT 培地において、H はヒポキサンチン（hypoxanthine）、A はアミノプテリン（aminopterin）、T はチミジン（thymidine）を表します。アミノプテリンを HAT 培地に添加する目的は、ヌクレオチド合成の主要経路を阻害することです。ヒポキサンチンとチンジンを添加することは、ヌクレオチド合成の代替経路（サルベージ経路）のための生体材料を提供し、細胞がこれらのヌクレオチドから DNA を合成できるようにするものです。

細胞の DNA 合成には、de novo（新規）合成経路とサルベージ合成経路の 2 つのパターンがあります。de novo 合成とは、アミノ酸やその他の小分子化合物からヌクレオチドを合成し、さらにこれらのヌクレオチドから DNA を合成するプロセスを指します。この過程において、ジヒドロフォレートレダクターゼが重要な補酵素として関与します。

サルベージ経路とは、ヒポキサンチングアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）とチミジキン（TK）によってヒポキサンチンおよびチミジンが対応するヌクレオチドに合成され、さらに DNA 合成が行われるプロセスです。この経路において HGPRT と TK は不可欠です。

腫瘍細胞はサルベージ経路の主要酵素である HGPRT を欠いているため、この経路を通じてヒポキサンチンを利用して DNA を合成することはできません。HAT 培地中では、アミノプテリンによって de novo 合成経路が阻害されるため、生存することができません。

B 細胞はヒポキサンチンとチミジンをサルベージ経路を通じて利用して DNA を合成できるため、HAT 培地中においても生存できます。しかしながら、B 細胞は無限に増殖する能力を持たないため、初期には生存してもすぐに死滅します。

成功した融合ハイブリドーマ細胞は、腫瘍細胞の無限増殖能力と B 細胞から由来するサルベージ経路酵素 HGPRT を継承しています。したがって、HAT 培地中においてサルベージ経路を通じてヌクレオチドを合成でき、継続的な生存および増殖を維持することができます。

第 2 のスクリーニング

モノクローナル抗体の製造において、B 細胞の特異性が異なるため、HAT 培地を用いて初めにスクリーニングされたハイブリドーマ細胞が産生する抗体も異なります。これには、特定の抗体を分泌する細胞、不関連の抗体を分泌する細胞、非抗体分泌細胞が含まれます。したがって、標的抗体を産生できるハイブリドーマ細胞を選別するための第 2 のスクリーニングが必要であり、その後クローニング（培養ウェル内の単一細胞からの培養および増殖による単クローン集団の形成）を行います。これにより分泌される抗体の均一性を確保します。

特定のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を選別するために最もよく使用される方法は、限界希釈アッセイ（limiting dilution assay）です。連続的勾配希釈の原理に従い、細胞懸濁液を連続的に極めて低密度に希釈して 96 ウェルプレートへ接種し、ウェル内に単一細胞クローンが出現するまで培養します。この方法は操作がシンプルで容易ですが、培養プロセス全体を通じて相対的に時間がかかります。具体的な手順は以下の通りです：

1. ELISA 法を用いて陽性ハイブリドーマ細胞ウェルを特定し、完全培地を含む細胞懸濁液を調製して細胞数をカウントします。

2. 細胞懸濁液を移りガラスまたは遠心管に移し、連続希釈を行って濃度を 5×10² cells/mL にします。

3. 希釈した細胞懸濁液を 96 ウェルプレートへ個別に接種し、インキュベーターで培養します。

4. 細胞接着後、逆転顕微鏡下で各ウェルの細胞数を観察し、単一細胞のみを含むウェルをマーキングして培養を継続します。インキュベーション中に培地の pH 値の変化に基づいて培地交換を行うかどうかを判断します。

5. 陽性ウェルの細胞が単一細胞由来であることが保証できない場合、限界希釈および前述の手順を繰り返して、ウェル内の増殖細胞がモノクローナルであることを確認するまで続行します。

注

抗体分泌が陽性であるハイブリドーマ細胞は、できるだけ早期にクローニングを行うべきです。さもなければ、非抗体分泌細胞によって抗体分泌細胞が阻害される可能性があります——非抗体分泌細胞の方が成長速度が速いため、2 つの細胞型間の競争の結果として、最終的に抗体分泌細胞が失われることになります。

クローンされたハイブリドーマ細胞でも、定期的な再クローニングが必要であり、細胞の突然変異や染色体欠失を防ぐ必要があります。これにより抗体産能が失われる可能性があります。

Felicia Felicia は EnkiLife の技術サポートスペシャリストであり、抗体開発、最適化、ELISA アッセイの設計および応用において豊富な専門経験を有しています。彼女は、当社のクライアントが適切な抗体製品を選択し、ELISA 実験プロトコルを最適化し、プロセスで遭遇する技術的問題を解決することを支援することに情熱を持ち、その生命科学研究プロジェクトの円滑な進行を支えています。