mIHC-TSA実験：主要な技術ポイントと典型的なQ&A

mIHC-TSA 実験：主要な技術ポイントと一般的な Q&A

I. 主要な技術ポイント

1. 抗原回収：抗原回収には通常、1×シトル酸（pH 6.0）を回収液として使用し、高温高圧での回収を行います。セクションをオートクレーブに入れ、適切な量の回収液を加えて密閉後、蒸気が現れたら 2 分間保温します。室温まで冷却することで回収が完了します。[弱く発現する標的については、EDTA（pH 9.0）を回収液として使用できます。骨や脳組織など剥離しやすい組織には、マイクロ波回収を推奨し、回収温度は約 80℃に設定し、2×シトル酸（pH 6.0）を回収液として使用します。]

2. 内因性酵素のブロック：精製した 3% H2O2 溶液に純粋な水を加え、セクションをその溶液中に入れ、室温で 20 分間インキュベートします。剥離しやすい組織については、H2O2 のインキュベート時間を適切に短くします。

3. 抗体の選択と希釈：モノクローン抗体の使用を優先し、ポリクローン抗体は避けてください。マウスのサンプルの場合、マウス由来の一次抗体を選択することを避けましょう。もしマウス由来の一次抗体を選択した場合、二次抗体は一次抗体だけでなく、組織中の内因性 IgG にも結合してしまい、非特異的な染色を引き起こします。一次抗体の希釈比率は前駆実験によって決定する必要があります。過剰な濃度は非特異的結合を招き、逆に濃度が低すぎるとシグナルが弱くなります。最適な条件を見つけるために濃度勾配を設定することを推奨します。

4. TSA 染色薬の使用方法：TSA 染色薬は光感受性物質であり、作業液は常に新鮮に調製する必要があります。低発現標の場合、高い蛍光強度と優れた抗褪色特性を持つ染料（Cy5、AF594 など）を選択し、TSA シグナル増幅効果を利用して検出率を高めることができます。高発現標の場合には、適度な蛍光強度を持つ染料（FITC、Cy3 など）を選択して、シグナルの飽和による詳細の隠れを防ぎます。

5. スペクトルオーバーラップ（波長重なり）を避ける：発光波長が約 50nm 以上離れている染料の組み合わせを選択してください。例えば：DAPI (461nm) + AF488 (519nm) + Cy3 (570nm) + Cy5 (670nm) はクロストークを効果的に減少できます。FITC (520nm) と AF488 (519nm)、または Cy3 (570nm) と AF594 (617nm) を同時に使用することは避けてください。

6. 顕微鏡機器との互換性：蛍光 TSA では、蛍光チャンネルが実験室の顕微鏡の波長と互い合うか確認する必要があります。一般的な蛍光顕微鏡では、コンフォーカル顕微鏡やマルチスペクトル顕微鏡を使用できます。実験前には、ご自身の機器のチャンネル数/フィルター数を決定し、機器のフィルターに一致する蛍光染料を優先的に使用してください。

7. 抗体洗脱効率： 一部の抗体が高滴度で高い親和性を持ち、完全に洗脱されにくい場合、洗脱ステップの回数を増やし、操作中にセクションが平らになるように注意してください。剥離しやすいサンプルの場合、洗脱液の温度を下げたりインキュベート時間を短くしたりします。

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II. 一般的な Q&A

1. 凍結浮遊切片を TSA 実験に使用できますか？

回答：TSA キットは浮遊切片には適していません。浮遊切片は厚すぎ、試薬の浸透が不十分になるためです。また、染色中に形が変わり（巻いたりシワが入ったり）、染色品質が低下する可能性があります。

2. パラフィン切片用 mIHC の抗体選択法は？

回答：モノクローン抗体の使用を優先し、IHC/mIHC/IHC-P に適応済みの抗体を選択してください。また、ノックアウト実験で検証された抗体を優先的に使用しましょう。

3. なぜ非特異的結合が起きるのか？

回答：a. ポリクローン抗体を使用すると非特異的結合が起きやすく、モノクローン抗体へ切り替えたり濃度や回収強度を下げたりすることで改善できます。b. シグナル増幅が強すぎると、染料反応時間または濃度を減らしてください。c. 一次抗体の濃度が過剰か抗原回収が強すぎる場合、一次抗体の希釈比率を低くしたり抗原回収の強度を弱めたりしてください。

4. セクション剥離を防ぐ方法は？

回答：a. スライドが剥離防止処理されていない場合は、剥離防止スライドを使用するか、剥離防止処理を行ってください。b. 組織固定が不十分または脱水が不十分な場合、サンプル前処理法を再最適化し、固定時間や脱水時間を延長してください。c. 過度な熱回収抗原回収を行った場合、マイクロ波回収を約 80℃以下で穏やかに実施するか、2×シトル酸（pH 6.0）を使用して回収液としてください。d. 洗脱液の温度が高すぎる場合は、洗脱液の温度を下げるかインキュベート時間を短くしてください。

5. なぜクロストークが起きるのか？

回答：a. 顕微鏡機器のフィルター帯域幅に関連している可能性があります。狭い波長帯域のフィルターを使用してください。b. 前回の抗体洗脱が不完全である可能性があります。CK などの高親和性を持つ抗体については、抗体洗脱条件を延長（洗脱温度や時間を増やすなど）してください。c. シグナルの不均衡に関連している可能性があります。隣接するチャンネル染料で一方が強すぎて他方が弱すぎると、強いシグナルのスピルオーバーが起きます。d. その他の理由としては、抗体の混同や次のラウンドでの洗脱/回収を忘れていることなどがあります。

6. マウスのサンプルでは、マウス由来の一次抗体を使用できますか？

回答：この方法は一般的に推奨されません。一次抗体がマウス由来の場合、二次抗体も抗マウスである必要があり、サンプル中に存在する IgG と交叉反応して非特異的結合を引き起こす可能性があります。 サンプルと同じ種由来の一次抗体を使用する必要がある場合は、非特異的シグナルが発生するかどうかを確認するために、一次抗体を含まず二次抗体のみを加えてネガティブコントロール実験を行うことを推奨します。

7. マルチプレックス染色でマーカー/抗体の順序をどう選ぶか？

回答：洗脱しにくい抗体を最後のラウンドに配置してクロストークを防ぎます。ウサギとマウスの一次抗体を交互に使用します。検出が難しいマーカーは早期のラウンドに配置します。低発現標の場合には、高い蛍光強度と優れた抗褪色特性を持つ染料を選択し、早期のラウンドに配置してください。高発現標の場合には、シグナル飽和による詳細の隠れを防ぐために適度な蛍光強度を持つ染料を選択します。2 つのタンパク質が共発現している場合、波長差の大きい染料を選択することをお勧めします。

8. 実験操作中に光を避ける必要がありますか？染色スライドはどれくらい保存できるか？

回答：EnkiLife TSA キットの蛍光染料は優れた抗褪色性能を発揮するため、意図的な遮光操作は必要ありません。ただし、直射日光への曝露や長時間の曝露を避けてください。染色スライドは通常、4℃で 6 ヶ月から 12 ヶ月保存できます。