mIHC多重免疫組織化学TSAキット

mIHC マルチプレックス免疫組織化学 TSA キット

生体医学研究および臨床診断の分野において、生物学的サンプル内のタンパク質発現量や空間分布を正確に把握することは、疾病メカニズムの解明と治療計画の最適化に向けた重要な前提条件です。従来の免疫組織化学技術は基本的な検出法として機能しますが、低発現量の標的を検出したり、同時多目標分析を行う際には、シグナルが弱い、特異性不足、ラベル付け能力に制限などの課題を抱えています。TSA（Tyramide Signal Amplification：酪アミドシグナル増幅）技術は、独自の酵素反応によるシグナル増幅メカニズムにより、従来の技術のボトルネックを打破します。この技術を基盤として開発された TSA キットは、複雑な技術原理を標準化し、操作が容易な実験ツールへと変換することで、高感度・高特異性の多彩な蛍光検出を一般研究室にもたらします。パラフィン切片から凍結組織、細胞サンプル、オルガノイドに至るまで、幅広いサンプル適合性と安定した検出性能を発揮する本 TSA キットは、空間プロテオミクス研究、腫瘍免疫微小環境解析、臨床病理学的精密診断などの分野において代替の得られない役割を果たします。

当社の TSA キットは、TSA ラベル付蛍光色素、TSA 希釈緩衝液、3% H2O2、ブロック溶液、一次抗体希釈緩衝液、抗体エリユート緩衝液、HRP-ヤギ抗ラビット/マウス IgG、DAPI 染色溶液、蛍光消光固定剤を含む全成分を備えたワンストップ実験ソリューションを提供し、実験の利便性を大幅に向上させています。本キットは、480〜750 nm の波長範囲をカバーする 7 色の蛍光基質を装備しており、必要に応じて自由に組み合わせることで、1 つの切片上で 7 プレックス情報の同時取得が可能になります。同時に、補助二次抗体はラビット/マウス等多種類の一次抗体と互換性があり、従来の種由来の制限を打破しています。さらに特製された緩やかな抗体エリユート緩衝液との組み合わせにより、抗原や蛍光シグナルを保持したまま抗体を除去でき、組織構造の完全性を維持しつつ 5〜7 回までの循環染色を行うことが可能です。これにより、マイクロ波熱修復に比べてサンプル損傷を大幅に低減できます。ユニバーサルな本キットは、パラフィン切片、凍結切片、細胞塗抹標本、オルガノイドなどの組織サンプルに幅広く適用可能であり、専門的な技術サポートおよび品質保証システムによって、利用中に発生する各種問題に対するタイムリーで効果的な解決策を受けられます。

表 1. マルチプレックス免疫組織化学検出用蛍光染料

表 2. TSA 完全キット成分

キット操作手順（パラフィン切片を例とする）：

1. デパラフィン化：切片をキシレン 1（15 分）、キシレン 2（15 分）、絶対エタノール 1（5 分）、絶対エタノール 2（5 分）、95% エタノール（5 分）、85% エタノール（5 分）、75% エタノール（5 分）の順に浸漬し、最後に水で洗浄する。

2. 抗原回収：高熱・高圧回収には通常、1×シトラート緩衝液（pH 6.0）を回収溶液として使用します。切片をオートクレーブに入れ、適切な量の回収溶液を加え、オートクレーブを閉めて蒸気が上がった後から 2 分間計時し、室温まで冷まして回収を完了させます。[発現が弱い標的については、EDTA（pH 9.0）を回収溶液として使用できます。骨や脳など容易に剥離する組織については、マイクロ波回収を推奨します。回収温度は約 80°C に制御し、2×シトラート緩衝液（pH 6.0）を回収溶液とします。]

3. 内因性酵素ブロック：純水で 3% H2O2溶液を調製し、切片を溶液中に置いた後、室温で 20 分間インキュベートします。剥離しやすい組織については、H2O2濃度とインキュベート時間を適宜減少させることができます。

4. ブロック：ブロック溶液を滴下して組織に加え、37°C で 30 分間インキュベートします。

5. 一次抗体インキュベーション：一次抗体を抗体希釈緩衝液で適切な濃度に希釈し、組織に滴下して加え、4°C で过夜（または 37°C で 1 時間）インキュベートします。

6. 二次抗体インキュベーション：HRP ラベル付二次抗体を組織に滴下して加え、37°C で 1 時間インキュベートします。

7. TSA リアグントインキュベーション：TSA-XXX 蛍光染料を組織に滴下して加え、37°C で 30 分間インキュベートし、その後 PBST で 3 回（各回 5 分）洗浄します。

8. 抗体エリユート：抗体エリユート緩衝液を組織に滴下して加え、室温で 15 分間インキュベートします（37°C インキュベーションの方が良い）。

9. ステップ 4-8 を繰り返し行います（他の TSA-XXX 蛍光染料をインキュベートするため）。

10. DAPI 核染色：DAPI ワーキング溶液を組織に滴下して加え、室温で 5 分間インキュベートし、その後 PBS で 3 回（各回 5 分）洗浄します。液体を遠心乾燥させ、蛍光消光固定剤を組織に滴下して加え、カバーガラスを載せて顕微鏡下に観察・撮影します。

実験上の注意

1. 一次抗体としてはモノクローナル抗体が推奨されます。マウスサンプルの場合は、可能な限りマウス由来の一次抗体を選択することを避けてください。マウス的一次抗体を選択した場合、二次抗体は一次抗体だけでなく、組織内にある内因性 IgG に結合し、非特異的染色を引き起こす可能性があります。

2. 組織が容易に剥離する場合は、60°C ウォーターバス法で回収を行うことができます。

3. 蛍光二次抗体と比較して、TSA キットはより高い感度と強力なシグナルを持ちます。したがって、一次抗体の濃度を低下させる必要があります。

抗体ラベル指示書に記載された希釈比率に基づき、一般的に適切な希釈比を増加させて背景蛍光を低下させます。最適な結果を得るために、一次抗体の勾配濃度設定を行うことを推奨します。

4. 背景蛍光が強い場合は、組織自己蛍光消去ステップを追加することを推奨します。

5. 抗体エリユート効果と蛍光マルチプレックスラベリング効果を確保するため、正式なマルチプレクスラベリングの前に各抗体に対して個別の TSA シングルラベルテストを実行し、シングルラベルテストの結果に基づいて（各抗体が理想的な陽性シングルラベル結果を生み出せることを確認した上で）、抗原回収条件やマルチプレクスラベリングの抗体順序などの実験条件を決定してください。

6. ある抗体が高チターで高い親和性を有し、完全にエリユートされにくい場合は、エリユートステップ数を増やすことができます。

7. 抗体エリユート緩衝液は流動性が強いため、スライドを水平に置かないと試薬が円から流れ出てしまい、エリユート効果が損なわれます。操作中にはスライドを平らにする点に注意してください。

表 3. 関連製品

さらに、当社はフルレンジの TSA ラベリングサービスを提供しています。標的の発現量に基づき最適な検出技術を選択し、マルチカラーラベリング実験に最も適した検出波長を用いてお選びいただけます。

6 ラベル 7 カラー結果表示：

ラット腎臓（6 ラベル 7 カラー）? 10×

ラット脳（6 ラベル 7 カラー）? 5x