トラブルシューティングガイド：ELISA
問題：高いバックグラウンド
| 原因 | テストまたは対策 |
|---|---|
| 洗浄が不十分 | 洗浄回数を増やす；洗浄間に30秒の浸漬ステップを追加 |
問題：シグナルが予想されるのにシグナルがない
| 原因 | テストまたは対策 |
|---|---|
| 試薬の添加順序が間違っているか、調製が不適切 | アッセイを繰り返す；計算を確認し、新しい緩衝液、標準品などを調製 プロトコルを確認 |
| HRPが 汚染されている | 新鮮な試薬を使用 |
| 使用した抗体が不足 | 濃度を増やす |
| 標準品が劣化（サンプルウェルにシグナルがある場合） | 標準品が指示通りに取り扱われたか確認 新しいバイアルを使用 |
| FCSを含む緩衝液で抗体を再構成 | 選択した試薬の再資格認定を行う |
| 捕捉抗体がプレートに結合しなかった | ELISAプレートを使用（組織培養プレートではない） 追加のタンパク質なしでPBSで希釈 |
| 緩衝液が汚染されている | 新しい緩衝液を調製 |
問題：シグナルが過剰 - プレート全体が均一に青くなった
| 原因 | テストまたは対策 |
|---|---|
| 洗浄が不十分/洗浄ステップをスキップ - 未結合のペルオキシダーゼが残留 | ステップ間の十分な洗浄を確保 |
| 基質溶液を早すぎに混合して青くなった | 基質溶液は混合後すぐに使用する必要がある |
| ストレプトアビジン-HRPが過剰 | 希釈を確認、必要に応じて滴定 |
| プレートシーラーまたは試薬リザーバーを再使用し、残留HRPが存在。これによりTMBが非特異的に青くなる | 各ステップに新しいプレートシーラーと試薬リザーバーを使用 |
| 金属またはHRPで汚染された緩衝液 | 新しい緩衝液を調製 |
問題：標準曲線が得られたが、ポイント間の識別性が低い（低いまたは平坦な曲線）
| 原因 | テストまたは対策 |
|---|---|
| ストレプトアビジン-HRPが不足 | 希釈を確認、必要に応じて滴定 |
| 捕捉抗体がプレートに十分に結合しなかった | ELISAプレートを使用（組織培養プレートではない） 追加のタンパク質なしでPBSで希釈 |
| 検出抗体が不足 | 希釈を確認、必要に応じて滴定 |
| プレートの発色時間が不十分 | 基質溶液のインキュベーション時間を延長 推奨ブランドの基質溶液を使用 |
| 手順が不正確 | 一般的なELISAプロトコルに戻る；変更があれば削除 |
| 標準曲線希釈の計算が不適切 | 計算を確認、新しい標準曲線を作成 |
問題：重複サンプルの再現性が低い
| 原因 | テストまたは対策 |
|---|---|
| 洗浄が不十分 | 自動プレート洗浄機を使用している場合は、すべてのポートが清潔で閉塞物がないか確認、30秒の浸漬ステップを追加し、洗浄の途中でプレートを回転させる |
| 手順の誤りまたはプレートの品質不良による不均一なプレートコーティング（不均一に結合する可能性） | 追加のタンパク質なしでPBSで希釈 コーティングとブロッキングの容量、時間、試薬添加方法を確認。使用したプレートを確認 ELISAプレートを使用（組織培養プレートではない） |
| プレートシーラーを再使用 | 各ステップに新しいプレートシーラーを使用 |
| プレートシーラーを使用しなかった | プレートシーラーを使用 |
| 緩衝液が汚染されている | 新しい緩衝液を調製 |
問題：アッセイ間の再現性が低い
| 原因 | テストまたは対策 |
|---|---|
| 洗浄が不十分 | 自動プレート洗浄機を使用している場合は、すべてのポートが清潔で閉塞物がないか確認 |
| インキュベーション温度の変動 | 推奨されるインキュベーション温度に従う 環境条件が変動する場所でのプレートインキュベーションを避ける |
| プロトコルの変動 | ラン毎に同じプロトコルに従う |
| プレートシーラーを再使用し、残留HRPが存在しTMBを青くする | 各ステップに新しいプレートシーラーを使用 |
| 標準曲線希釈の計算が不適切 | 計算を確認、新しい標準曲線を作成 内部コントロールを使用 |
| 緩衝液が汚染されている | 新しい緩衝液を調製 |
問題：シグナルが予想されるのにシグナルがないが、標準曲線は良好
| 原因 | テストまたは対策 |
|---|---|
| サンプル中にサイトカインがない | 内部コントロールを使用 実験を繰り返し、実験パラメータを再考する |
| サンプルマトリックスが検出をマスキングしている | 適切な希釈液でサンプルを少なくとも1:2に希釈するか、より好ましくは回収率を確認するために一連の希釈を行う |
問題：サンプルの読み取り値が高すぎるが、標準曲線は良好
| 原因 | テストまたは対策 |
|---|---|
| サンプルにはアッセイ範囲を超えるサイトカインレベルが含まれている | サンプルを希釈して再実行 |
問題：プレート全体で読み取り値が非常に低い
| 原因 | テストまたは対策 |
|---|---|
| 波長が不正確 | フィルター/リーダーを確認 |
| 発色時間が不十分 | 発色時間を延長 |
| コーティングプレートが古くて劣化 | 新しいプレートをコーティング |
| 捕捉抗体がプレートに結合しなかった | ELISAプレートを使用（組織培養プレートではない） 追加のタンパク質なしでPBSで希釈 |
| FCSを含む緩衝液で抗体を再構成 | 選択した試薬の再資格認定を行う |
問題：ストレプトアビジン-HRP使用時にストップ溶液を添加すると緑色が発生する
| 原因 | テストまたは対策 |
|---|---|
| ウェル内の試薬が十分に混合されていない | プレートをタップ |
問題：エッジ効果
| 原因 | テストまたは対策 |
|---|---|
| 作業面周辺の温度が不均一 | 環境条件が変動する場所でのプレートインキュベーションを避ける |
| プレートシーラーを使用 |