HepG2ヒト肝癌細胞は、15歳の白人男性肝細胞癌患者から樹立された細胞株で、上皮様形態と付着性増殖の特徴を持ちます。これらの細胞は、in vitroで培養すると密接に結合した小島状構造を示し、層状に増殖し、高い増殖率を持ちます。HepG2細胞株は、肝癌研究、薬物代謝、毒性評価に広く使用され、肝機能と疾患を研究するための重要なツールです。
HepG2細胞は、α-フェトプロテイン、アルブミン、α-2-マクログロブリン、インスリン受容体、IGF II受容体など、さまざまな肝臓特異的タンパク質と受容体を発現します。さらに、3-ヒドロキシ-3-ホルミルCoAレダクターゼと肝トリグリセリドリパーゼ活性も発現します[2,3]。
HepG2細胞は培養過程で特定の条件を必要とし、例えば10%ウシ胎児血清を含む培地を使用し、培地のpH値と血清品質に高い要求があります[3]。これらの細胞は通常、37℃、95%空気、5%二酸化炭素の環境で培養されます。
HepG2細胞は、無限の増殖、安定した表現型、操作の容易さなど多くの利点を持ちますが、代謝機能の発現は低く、一部の代謝研究では初代肝細胞ほど良くない場合があります[1]。しかし、低コスト、取り扱いの容易さ、入手性の良さから、HepG2細胞は依然として肝癌研究における不可欠なモデルです[1]。
まとめると、HepG2細胞株は肝癌研究において重要な役割を果たしており、その独特な生物学的特性と広範な応用範囲により、肝癌研究における重要なツールとなっています。
起源と歴史的背景
HepG2細胞株の起源と歴史的背景は1975年にさかのぼります。当時、15歳の白人アルゼンチン人少年の肝臓腫瘍生検から得られました。これらの腫瘍組織は当初、肝細胞癌（HCC）と記載されましたが、後の研究により、実際には肝芽腫（HB）の一種であることが明らかになりました[12]。この誤分類は30年間混乱を引き起こし、Lopez TerradaらがHepG2の特性を調査するまで修正されませんでした[12]。
HepG2細胞株は、血漿タンパク質の合成と分泌、コレステロールとトリグリセリド代謝、リポタンパク質代謝と輸送、胆汁酸合成、グリコーゲン合成など、その独特な機能的特性により、科学研究で広く使用されています[15]。さらに、薬物代謝、ヒト毒性学、癌研究、肝疾患、遺伝子調節メカニズム、バイオマーカー発見などの分野で使用されてきました[14]。
HepG2細胞株は、ほぼ無限の寿命、安定した表現型、高い入手性、操作の容易さなど多くの利点を持っていますが、いくつかの欠点もあります。例えば、薬物代謝酵素と輸送体の発現は制限されており、ほとんどの薬物代謝CYP遺伝子の発現量は低いです。長期間培養すると、この細胞株のタンパク質発現レベルが変動する可能性があり、実験データの再現性に影響を与える可能性があります[15]。
薬物代謝と毒性評価における応用例
HepG2細胞の薬物代謝と毒性評価における具体的な応用例は、以下の側面に含まれます：
1. Drug metabolism research:
oCYP酵素の発現が強化されたHepG2細胞：アデノウイルストランスダクション技術を使用することで、HepG2細胞はCYP2C9、CYP3A4などの特定のシトクロムP450（CYP）酵素を発現することができ、薬物代謝研究の能力が向上します。例えば、ある研究では、CYP酵素の発現が強化されたHepG2細胞を使用して、薬物代謝物の変化を評価し、薬物相互作用を予測しました[18]。
薬物代謝経路の研究：HepG2細胞は、エチレンジアミンの代謝などの特定の代謝経路の研究に使用されました。細胞株におけるメチオニンの酸化を制御することで、HepG2細胞における一次および二次代謝酵素の役割を推測することができます[17]。
2. 毒性評価：
薬物誘発性肝障害（DILI）： HepG2細胞を使用して単一または複数のCYP酵素を発現させ、ハイスループットスクリーニング（HCS）戦略と組み合わせることで、代謝依存的な薬物毒性を評価し、感受性の高い代謝表現型を同定することができます。例えば、研究によると、HepG2細胞が高レベルのCYP酵素を発現すると、生物学的に活性化された薬物に対する感受性が高まることが示されています[20]。
従来の鎮静剤およびオピオイド薬物の肝毒性試験： HepG2/C3A細胞株は、機能性の高いHepG2クローン由来細胞株で、従来の鎮静剤およびオピオイド薬物の肝毒性を試験するために使用できます。これらの細胞株はほとんどの血漿タンパク質を合成することができ、高い生理学的反応性と代謝マーカーを持ち、ヒトの肝毒性を予測するための効果的なツールとなっています[21]。
薬物誘発性肝障害の予測：WT-HepG2細胞とCYPS-UGT1A1 KI-HepG2細胞に5種類の肝毒性薬物を処理した結果、後者の方が薬物誘発性肝毒性に対して敏感であることが判明し、薬物誘発性肝障害の予測における応用価値が確認されました[18]。
3. その他の応用：
薬物代謝酵素のレベルとその誘導の研究：ジメチルスルホキシド、ツバキ抽出物、トピラマートなどの異なる薬物がHepG2細胞に与える影響、および細胞生存率、ミトコンドリア機能、グルコース代謝への影響が研究されました[16]。
薬物代謝と毒性スクリーニング：HepG2細胞は、薬物代謝と毒性スクリーニング、特に候補薬物化合物の初期スクリーニングに広く使用されています。例えば、特定の化合物のCYP特異的基質に対する阻害効果と細胞活性の変化を検出することで、化合物の時間依存的阻害と毒性を評価することができます[19]。
要約すると、HepG2細胞はその安定性と操作の容易さから、薬物代謝と毒性評価に広い応用展望を持っています。
HepG2細胞と初代肝細胞の代謝機能発現における具体的な違いは何ですか？
HepG2細胞と初代肝細胞の代謝機能発現の違いは主に以下の側面に反映されています：
1. 薬物代謝酵素の発現：
OCYP酵素：HepG2細胞におけるCYP3A4などの酵素の発現レベルは初代肝細胞よりも大幅に低く、これらの酵素は薬物代謝において重要な役割を果たしています[12]。例えば、HepG2細胞におけるCYP3A4の発現は肝細胞の100-400倍に過ぎません[12]。
OUGTファミリー酵素：UGTファミリー酵素（UGT1A1、UGT1A4、UGT1A6、UGT2B7、UGT2B15、GSTM1など）のHepG2細胞における発現は非常に低いか完全に存在しないため、これらの酵素は様々な抗癌剤の代謝において重要な役割を果たしています[12]。
OSULT酵素：肝細胞とHepG2細胞におけるSULT1A1とSULT2A1の濃度に有意な差はなかったが、HCC症例の50%でSULT2A1のレベルが低下していました[12]。
2. 輸送蛋白質の発現：
HepG2細胞におけるBSEP蛋白質のレベルは肝細胞の1/100に過ぎません[12]。
OMRP輸送体：MRP4はHepG2細胞で検出されず、MRP3とMRP6のレベルは肝細胞よりもわずか4-20倍高いに過ぎません[12]。
3. 遺伝子発現と代謝経路：
遺伝子発現の差：HepG2細胞における薬物と異物代謝に関連する多くの遺伝子発現変化は、薬物代謝分析の精度と相関性に影響を与える可能性があります[22]。例えば、HSD17B6およびHSD17B13遺伝子の肝細胞株における発現レベルは初代肝細胞よりも低いです[22]。
脂質代謝：HepG2細胞株における酢酸、クレアチン、イソロイシン、ロイシン、およびフェニルアラニンのレベルの上昇は、脂質代謝の差を示しています[12]。
4. 細胞エネルギー代謝：
HepG2細胞は細胞エネルギー代謝の点で初代肝細胞と異なり、例えば、HepG2細胞はコレステロール分泌を著しく減少させます[23]。
5. その他の代謝機能：
HepG2細胞は、内源性および外源性物質代謝に関連する全身性の変化を保持・増幅しており、これは肝芽細胞腫および肝細胞癌細胞で観察されるものと類似しています[12]。
HepG2細胞の培養条件を最適化して代謝機能発現を高めるにはどうすればよいですか？
HepG2細胞の培養条件を最適化して代謝機能発現を高めるためには、以下の点を考慮することができます：
1. 培地の選択と組成の調整：
10%胎児牛血清（FBS）と1%ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEMまたはRPMI-1640培地を使用するのが一般的です[26,29,31]。代謝機能をさらに最適化するには、グルタミンやG418などの特定の代謝調節因子を添加することを検討することができます[27]。
2. ガス環境と温度制御：
細胞は37℃、5% CO2の湿潤環境で培養する必要があります[26,31]。さらに、低酸素前処理と再酸素化段階の制御も代謝機能に大きな影響を与え、モジュラーインキュベーターを使用して実現できます[27]。
3. 三次元培養条件：
CVMチャンバーを使用して固液界面、液液界面、気液界面で培養するなどの三次元培養条件は、アルブミン分泌、尿素合成、CYP3A4活性レベルなど、HepG2細胞の肝機能性能を大幅に向上させることができます[34]。さらに、混合ハイドロゲル（PC4/Cultrexなど）の割合の最適化も細胞の増殖と分化に寄与します[30]。
4. 代謝物のバランスと測定：
培養過程では、グルコース、乳酸、アミノ酸などの細胞外代謝物の濃度を定期的に測定することで、細胞の代謝状態を理解し、ハイスループット液体クロマトグラフィーなどの方法で定量分析を行うことができます[28]。
5. 遺伝子修飾と薬物処理：
HepG2細胞の遺伝子修飾（特定の遺伝子のノックアウトや挿入など）により、その代謝機能を高めることができます。例えば、TRET1スクローストランスポーターとAfrLEA2遺伝子を発現するHepG2細胞は、代謝実験においてより良い性能を示しました[27]。また、リラグルチドなどの薬物処理も細胞代謝機能を大幅に改善することができます[24]。
6. 細胞密度と継代条件：
細胞密度が80%-90%に達した場合、継代培養を行うのが通常の手順です。また、接種密度と培養時間を調整すること（例えば、7.5×10^3細胞/ウェルの接種密度と7-8日間の培養時間）により、高品質な多方向分化細胞（MCTS）を得ることができ、それによって細胞の代謝機能が向上します[25]。
HepG2細胞株は肝癌研究においてどのような限界があり、これらの限界はどのように克服できますか？
HepG2細胞株は肝癌研究に広く応用されていますが、その限界も無視できません。以下はHepG2細胞株の肝癌研究における主な限界とその克服方法です：
限界
正常肝細胞と比較して、HepG2細胞株は肝臓の重要な代謝酵素の発現レベルが低く、通常代謝能力が低いです[32]。これにより、HepG2細胞株は肝毒性化合物の代謝と排泄を予測する能力が制限されています。
HepG2細胞株と正常肝細胞には、P450遺伝子の変化などの有意な差があります。さらに、HepG2細胞株のCTNNB1遺伝子変異は肝癌の高発生率に関連しており、正常肝細胞では一般的ではありません[12]。
同じ細胞株からのサンプルでも有意な差が見られ、これは交叉感染やマイコプラズマ感染による可能性があります[12]。この不均一性により、癌モデルとしての予測価値が制限されています。
HepG2細胞株は物質代謝に関与する重要なタンパク質の発現が不十分で、吸収輸送体と第一相酵素が不足しています[12]。これは、この細胞株を使用して肝細胞内の異物の代謝と排泄を予測する際には注意が必要であることを示しています。
HepG2細胞は形態学的に正常肝細胞と類似していますが、ミトコンドリアと小胞体は発達が不良で、数が減少し、構造的に異常です[12]。これらの構造的な差異は、細胞の機能と代謝活性に影響を与える可能性があります。
克服方法
HepG2細胞株の代謝能力が低い問題を克服するには、HepaRGなどの他の肝癌細胞株を検討することができます。HepaRGはより多くの第二相代謝酵素とより高い膜輸送体活性を発現します[32]。
三次元球形細胞培養システムを確立することで、細胞を球形に変換し、生理的システムにより近いシステムを作成します。細胞色素を含む三次元球形HepG2モデルの代謝活性は、二次元細胞よりも高く、正常肝細胞により近いです[12]。
CRISPR-Cas9などの遺伝子編集技術を使用してHepG2細胞を改変することで、重要な代謝酵素の発現レベルが向上し、肝細胞モデルとしてより適したものになります[12]。
研究に複数の肝癌細胞株を組み合わせて使用することで、単一細胞株によるバイアスを減らすことができます。例えば、HepG2と他の肝癌細胞株（Huh7など）の研究結果を組み合わせると、より包括的なデータサポートを提供できます[33]。
in vitro実験の結果を基に、in vivoモデルで化合物の有効性をさらに検証します。例えば、候補薬の効果をマウス肝癌モデルで試験することで、in vitro実験結果の信頼性を確保します[33]。
References
1. Advances in the study of metabolism of psychoactive substances based on mass spectrometry. Zhang Ganteng et al. [2023-01-31]
2. Human hepatocellular carcinoma cell Hep G2 [HEPG2]. Chinese Academy of Sciences Committee for the Preservation of Typical Culture Collection.
3. Human hepatocellular carcinoma Hep G2 [HEPG2] cell specification. Chinese Academy of Sciences Committee for the Preservation of Typical Culture Collection.
4. Study on antagonistic effect of berberine combined with fluorouracil on human hepatocellular carcinoma cell HepG2. CAI Jingbin et al.
5. Angiotensin II affects the proliferative capacity of HepG2 cells through AT1/Raf/ERK1/2 signaling pathway [J]. Chinese Journ,2018,26 (8): 601-606. [2018-08-20]
6. Study on the in vitro and in vivo anti-liver cancer effects of gemcitabine. Sun Jiayue et al. [2014-12-31]
7. Effect of total ginsenosides on HepG2 liver cancer tumor-bearing mice. Feng Duo et al. [2023-12-31]
8. Study on the apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 induced by kineptine. Si Weike et al. [2001-06-30]
9. Veratramine suppresses human HepG2 liver cancer cell growth in vitro and in vivo by inducing autophagic cell death. [PMID: 32468056]
10. CpG oligodeoxynucleotides enhance chemosensitivity of 5-fluorouracil in HepG2 human hepatoma cells via downregulation of the antiapoptotic factors survivin and livin.
[PMID: 24161202]
11. In vitro siRNA-GAS5 interferes with the biological behavior of HepG2 hepatocellular carcinoma cells. Huang Haifeng et al. [2018-08-21]
12. The Curious Case of the HepG2 Cell Line: 40 Years of Expertise. [PMID: 34884942]
13. Estudio del metabolismo lipídico de ratas con trasplante renal y de células de hepatoma humano -HEPG2- bajo el tratamiento con distintos inmunodepresores.
14. Haplotype-resolved and integrated genome analysis of the cancer cell line HepG2. [PMID: 30864654]
15. Application of in vitro models in the study of metabolism of Traditional Chinese medicine. Wang Sha et al. [2020-01-26]
16. Pre-Clinical Assessment of the Potential Intrinsic Hepatotoxicity of Candidate Drugs. Jacob John van Tonder et al.
17. New insights into ethionamide metabolism: influence of oxidized methionine on its degradation path. [PMID: 28762043]
18. Generation of HepG2 Cells with High Expression of Multiple Drug-Metabolizing Enzymes for Drug Discovery Research Using a PITCh System. [PMID: 35626714]
19. Establishment of a novel hepatocyte model that expresses four cytochrome P450 genes stably via mammalian-derived artificial chromosome for pharmacokinetics and toxicity studies. [PMID: 29065189]
20. Customised in vitro model to detect human metabolism‑dependent idiosyncratic drug‑induced liver injury. [PMID: 28762043]
21. In Vitro Hepatotoxicity of Routinely Used Opioids and Sedative Drugs. [PMID: 38666919]
22. Comparative Transcriptomic Analysis of Three Common Liver Cell Lines. [PMID: 37240140]
23. Cholesterol-secreting and statin-responsive hepatocytes from human ES and iPS cells to model hepatic involvement in cardiovascular health. [PMID: 23874411]
24. A stem cell expressing GLP-1 and FGF21 and its use. China National Intellectual Property Administration, etc. [2023-01-05]
25. Pharmacokinetic and pharmacodynamic evaluation based on 3D multicellular tumor sphere model. Ao Luyao et al. [2020-12-31]
26. Mechanisms of 4-hydroxy-2-nonenal induced pro- and anti-apoptotic signaling. [PMID: 20565132]
27. Metabolic Preconditioning of Mammalian Cells: Approaches for Increasing Biostability after Desiccation.
28. Metabolic Flux Distribution during Defatting of Steatotic Human Hepatoma (HepG2) Cells. [PMID: 26742084]
29. Extracellular Citrate Treatment Induces HIF1α Degradation and Inhibits the Growth of Low-Glycolytic Hepatocellular Carcinoma under Hypoxia. [PMID: 35884416]
30. Bioinspired Sandcastle Worm-Derived Peptide-Based Hybrid Hydrogel for Promoting the Formation of Liver Spheroids. [PMID: 35323262]
31. Emodin, an Emerging Mycotoxin, Induces Endoplasmic Reticulum Stress-Related Hepatotoxicity through IRE1α-XBP1 Axis in HepG2 Cells. [PMID: 37505724]
32. Research status and progress of in vitro models of hepatotoxicity of exogenous compounds. Cao Xin et al. [2021-09-14]
33. Cellular Genome-Scale Metabolic Modeling Identifies New Potential Drug Targets Against Hepatocellular Carcinoma. [PMID: 36508280]
34 .Development of an oxygenation culture method for activating the liver-specific functions of HepG2 cells utilizing a collagen vitrigel membrane chamber. [ PMID: 26660096]