ELISA操作手順

操作手順

• 抗体のコーティング： 実験の必要性に応じて、炭酸バッファー（CBS）またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いてコーティング抗体を必要な希釈倍率に希釈します。ウェルあたり100μLをコーティングし、37°Cで2時間または4°Cで一晩インキュベートします。
• ウェル内の液体を捨て、乾燥させた後、10 mM PBST（10 mM PBS + 0.05% Tween-20）で2回洗浄します。毎回1-2分間浸し、ウェルあたり350μLを使用し、乾燥させます（ウェル内の液体を軽くタップして除去することもできます）。
• 1% BSAまたは5%スキムミルクを含む10 mM PBST（10 mM PBS + 0.05% Tween-20）でブロッキングします。ウェルあたり350-400μLを使用し、37°Cで2時間インキュベートします。
• プレートの洗浄： ステップ2に従います。                注：市販キットのELISAプレートには通常、捕捉抗体が事前にコーティングされているため、ステップ1-4は一般的に不要です。使用前に確認してください。
• サンプルの添加： ブランクウェル、標準ウェル、サンプルウェルを設定します。ブランクウェルには100μLのサンプル希釈液を添加し、残りのウェルには100μLの標準液またはサンプルを添加します。                注：泡を避け、サンプルをウェルの底に添加し、ウェル壁に触れないようにしてください。1枚のプレートへのサンプル添加は10分以内に完了してください。                ELISAプレートに蓋またはフィルムをかけ、37°Cで60-120分間インキュベートします。実験結果の有効性を確保するため、毎回新しい標準溶液を使用してください。
• ウェル内の液体を捨て、乾燥させた後、10 mM PBST（10 mM PBS + 0.05% Tween-20）で4回洗浄します。毎回1-2分間浸し、ウェルあたり350-400μLを使用し、乾燥させます（ウェル内の液体を軽くタップして除去することもできます）。
• 検出抗体の添加： 実験要件に応じて、PBSTで検出抗体を一定の希釈倍率に希釈し、ウェルあたり100μLを添加し、37°Cで1時間インキュベートします。
• プレートの洗浄： ステップ6と同様です。
• 二次抗体の添加： 10 mM PBSTで二次抗体を必要な希釈倍率に希釈し、ウェルあたり100μLを添加し、37°Cで1時間インキュベートします。
• プレートの洗浄： ステップ6と同様です。
• TMBの添加： 各ウェルに100μLのTMB基質溶液を添加し、37°Cで暗所にて10-30分間インキュベートします（発色が過剰にならないように、実験要件に応じて時間を調整してください）。
• 停止液の添加： 発色が予想されるレベルに達した後（例えば、標準ウェルにグラデーションの色が現れた場合）、各ウェルに50μLの停止液（例：2Mクエン酸）を添加して酵素反応を停止させます（この時点で青色が黄色に変化します）。
• ELISA測定： 630 nmを較正波長として使用し、ELISAリーダーで各ウェルの吸光度（OD値）を450 nmで順番に測定します。停止液添加後5分以内に値を読み取ってください。