Q1：一次培養細胞と細胞株の違いとは何ですか？
A1：従来の定義によると、組織から最初に回収・接種された細胞は一次培養細胞と呼ばれます [Freshney, R.I. (1987). Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique. (New York, Alan R. Liss, Inc.)]。これらの細胞は直接組織から分離され、有限な寿命を持ち、数回のパスージ（継代）後に次第に増殖を停止します。細胞集団内の遺伝子型と表現型の整合性を保つためには、その有限な寿命の間で成長空間を最大化する必要があります。一方、細胞株は、無制限の増殖潜在能力を持つように遺伝的に修飾された、連続的に増殖・分化する細胞集団です。in vitro で培養される細胞株は医学的または研究目的に使用されます。
Q2：増倍数とパージ回数（継代回）の違いとは何ですか？
A2：増倍とは、培養中の細胞総数の 2 倍化を指し、通常は指数増殖期または対数増殖期に起こります。パージ回数（継代回）とは、培養フラスコからサブカルチャー（継代）するために細胞集団が転移される回数を指します。サブカルチャーの目的は、細胞を低密度に保ち、さらなる成長を刺激することです。
Q3：細胞培養中に培地をどの頻度で交換すべきですか？
A3：これは細胞の増殖速度に依存します。一般的には、培地は 2-3 日ごとに交換されます。多くの細胞培養実験室では、月曜日、水曜日、金曜日に培地を交換するのが一般的です。注意：凍結保存した細胞を解冻した後、残存する DMSO と死滅した細胞を除去するために、6-16 時間以内に培地を交換してください。
Q4：一次正常ヒト細胞を拡張し、再凍結保存することは可能ですか？
A4：これは細胞の種類に依存します。ニューロン、グリア細胞、そして一部の増殖の遅い上皮細胞などは、拡張および再凍結保存には推奨されません。一方、線維芽細胞、アストロサイト、メサンギアル細胞などの他の細胞種は、拡張し、再凍結保存することができます。ただし、再凍結保存のプロセスが細胞の増殖能に 변화를（変化）を招く可能性があることに注意してください。
Q5：培養フラスコにどの量の培地を加えるべきですか？
A5：私たちが推奨する体積は以下の通りです：T-25 フラスコ：5ml、T-75 フラスコ：15ml、T-150 フラスコ：30ml。
Q6：一次細胞が培養でうまく接着しない場合、どうすればよいですか？
A6：多くの一次細胞は、接着・増殖するために接着促進物質の添加を必要とします。培養フラスコを事前にコート（コーティング）することができます。一般的なコート溶液には、ポリ-L-リシン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、コラーゲン、MSC 用接着促進剤、コンカナバリン A などがあります。あるいは、事前に処理された表面を備えた消耗品を直接購入することもできます。例えば：TC 処理された細胞培養表面；Nunclon Delta 細胞培養表面；球体培養、組織培養、3D 培養用のフラスコ；ポリ-D-リシンまたは第Ⅰ型コラーゲンでコーティングされた T25 フラスコなど。
Q7：培養細胞が接着しない場合、どうすればよいですか？
A7：考えられる原因：
(1) トリプシンによる過消化。
(2) マイコプラズマ汚染。
(3) 一部の細胞は追加の接着因子を必要とします。
(4) 不適切な培養容器、例えば非 TC 処理フラスコを使用した場合。
解決策：
(1) トリプシン消化時間を短くするか、トリプシンの濃度を低下させる。
(2) 培養を隔離してマイコプラズマを検出する。フードとインキュベーターを消毒する。もしマイコプラズマ汚染が検出された場合、その培養は廃棄してください。
(3) 培地組成を変更する。
(4) 適切な培養容器を使用する。
Q8：細胞の解冻および凍結保存における注意点は何か？
A8：注意点：
(1) 凍結保存する際には、細胞の状態が良好であることを確認してください：対数増殖期にあり、適度な密度（通常は 70%-80%）で、汚染がないこと；
(2) 凍結保存中に細胞を慎重に取り扱ってください。長時間の消化や繰り返しのピペッティング（吸引・吐出）を避けてください；
(3) 凍結保存に適した細胞数を確保してください：通常チューブあたり 1ml の凍結培地で、約 2*106細胞。脆弱な細胞または密度依存性の細胞の場合、細胞数は約 5*106にすることができます；
(4) 凍結保存する際、キャップをしっかりと閉め、対応するチューブとキャップを使用してください；
(5) 凍結保存時に細胞を直接 -80°C に置かないでください。厳密にグラデーション冷却を行ってください。一晩冷凍後、直ちに液窒素タンクから -80°C を経て長期保存用へ転移してください；
(6) 細胞を解冻する際、水浴槽を使いすぎないでください。室温が低い場合、水浴温度を適切に 38°C に上げることができます；
(7) 液窒素タンクから取り出したら、すぐに水浴槽に入れて解冻してください。凍結管用を優しく揺らして急速な融解を助け、できるだけ早く遠心分離して凍結培地を除去し細胞損傷を軽減してください；
(8) 細胞を優しくピペッティングし、事前温めた完全培地を用いて培養してください。
Q9：細胞の周りと表面に黒い点がたくさんある場合、どうすればよいですか？
A9：細胞内の黒い点は、一般的に細胞デブリ（破片）または血清沈降物の不純物と判断されます。懸濁培養細胞の場合：低速度遠心分離（500-600 rpm、5-6 分）で培養上清を回収し、培養皿を交換してください。接着性細胞の場合：PBS で 2-3 回洗浄し、洗浄中に培養皿を優しく叩いて緩く付着したデブリと粒子を剥離させ、その後 PBS を廃棄してください。消化の際には、まず低濃度のトリプシン（例：0.05%）を加えて約 1 分間消化し、細胞間の隙間のデブリを剥離します。低濃度トリプシンを除去後、通常通り細胞を消化します。細胞懸濁液を回収して低速度で遠心分離（500-600 rpm、5-6 分）し、新しい培養皿に移植して培地中の血清濃度を増やすようにします。マイコプラズマ汚染が疑われる場合は、マイコプラズマ検査を行ってください。
Q10：培養培地が汚れているように見える場合？
A10：考えられる原因：
(1) 直近に解冻された細胞で、死滅した細胞がたくさんある；
(2) 細胞の状態が悪く、分泌が増加している；
(3) 細胞汚染。
解決策：
(1) 古い培地をすべて除去し、PBS で 2 回洗浄してから新鮮な培地を加える；
(2) 新鮮な培地で置き換え、血清含有量を増やす；
(3) 細胞を廃棄して新しいものを解冻するよう推奨します。
Q11：細胞の分化が著しい場合？
A11：考えられる原因：
(1) パージ回数が過度に多い；
(2) パージ時のピペッティングが過度に激しい；
(3) 細胞自体が感受性が高い。
解決策：
(1) パージ回数を減らし、低いパージ数で細胞を凍結保存する；
(2) パージ時に優しくピペッティングする；
(3) 感受性が高い細胞の場合、緩やかな試薬と操作を使用してください。例えば：試薬を事前温める；EDTA を含まないトリプシンを使用する；細胞スクレイパー（スキャーパ）を使用するなど。
Q12：細胞増殖が遅い場合？
A12: 考えられる原因：
(1) 新しいバッチの血清または培地に変更しましたか？細胞に適応する時間が必要です；
(2) 培地に特定の成長因子が不足している可能性があります。最適な培地が利用できない場合は、まず元の条件で一部細胞を凍結保存し、その後新培地の比率を段階的に増加させます：25%、50%、75% から 100% にし、3-5 パージ後に細胞に適応させる；
(3) 培地汚染を確認してください。最初に抗生物質なしで細胞の状態を観察します；
(4) 接種密度が低すぎる場合、細胞増殖が遅くなります。接種密度を増加させます；
(5) 老化が観察されたら新しい細胞で置き換えます；
(6) マイコプラズマ汚染が疑われる場合、疑わしい培養を隔離し、インキュベーターを直ちに清掃・消毒して、マイコプラズマ除去剤を使用するか細胞を廃棄してください。
Q13：細胞内の小胞は正常な現象ですか？
A13：一部の細胞は天然に小胞を含んでいます（例：HepG2、Huh-7、および一部の耐性菌株など）。これは正常です。ごく少数の細胞が非常に少ない数の小胞を持っている場合、それは細胞の状態が悪いことを示している可能性があります。
Q14：細胞培養における小胞化（Vacuolation）についてどうすればよいですか？
A14：考えられる原因：
(1) 細胞老化：細胞が終末分化している、または過度なパージを経験しています；
(2) pH値：培地の pH が細胞の最適 pH と大きく異なる；
(3) トリプシン消化：長時間の消化または過度なピペッティング力；
(4) オートファジー：栄養不足がオートファジーを引き起こします；
(5) 細胞代謝：血清濃度が不足している、薬物効果、または外部刺激による代謝問題；
(6) 汚染：クラミジア、マイコプラズマ、またはウイルス感染。
解決策：
(1) 老化による場合、低いパージ数の細胞を解冻します；
(2) pH の問題の場合、培地を適切な pH に調整します；
(3) 適切なトリプシン濃度と消化時間を使用し、過度なピペッティングを避けます；
(4) 十分な栄養を確保するために血清濃度を増加させ、グルタミンを追加します；
(5) 厳密な無菌操作を行ってください。信頼性の高いソースから高品質の FBS を使用します。
Q15：懸濁培養細胞を培養する際に、多くの細胞デブリと死滅した細胞がある場合、どうすればよいですか？
A15：段階的に異なる速度で遠心分離して細胞を分離します。まず、200-300 rpm で 3 分間遠心分離して死滅した細胞塊と大きなデブリを取り除き、上清を回収します。その後、上清を 600-800 rpm で 3 分間遠心分離して小さなデブリを取り除き、細胞沈降物を回収します。まだ多くのデブリがある場合は、このプロセスを複数回繰り返します。
Q16：懸濁培養細胞に黒い粒子が現れる
A16：考えられる原因：
(1) 細胞状態が悪く、デブリが凝集している；
(2) 細胞が大きな塊として増殖し、内部の細胞は低酸素のために死んでいる；
(3) 細胞汚染。
解決策：
(1) 低速度遠心分離でデブリを取り除き、血清濃度を増やして細胞状態を改善する；
(2) カルシウム/マグネシウムフリーのバランスドサルト溶液で細胞を洗浄し、優しくピペッティングして単一細胞懸濁液を得て、低密度でプレートに接種することで徐々にデブリを取り除く；
(3) 汚染の種類を特定し、適切な抗生物質またはマイコプラズマ除去剤を追加する；
Q17：半接着性/半懸濁細胞がうまく接着せず、容易に剥離する？
A17：細胞を慎重に取り扱い、プレートを加振りは避けてください。培地交換時には、培地を 37°C に事前温め、細胞の撹乱を最小限にするために壁に沿ってゆっくりと加液します。一部の細胞は接着のためにコートが必要です。一般的なコート溶液には：コラーゲン、ポリリシン、フィブロネクチン、ゼラチンなどがあります。
Q18：細胞の剥離とハンドリング時の転がりに対する解決策
A18：接着性の低い細胞は、高密度で刺激される際に剥離しやすい傾向があります。このような細胞は、メディアや試薬を事前温めて急激な温度変化を避けるように取り扱ってください。ピペッティング管を使って試薬を容器の壁に沿って優しく加液します。もし剥離が起きたら、トリプシン処理して再懸濁し、再接種してください。
Q19：培養中の細胞剥離の原因は何ですか？
A19：培養中の細胞剥離の原因：
(1) 培地の pH が適切か（通常 pH 7.3-7.4）？培養中、活発な代謝により pH が低下し、培地は黄色く変化します（フェノールレッド指示薬を使用）。培地をすぐに交換してください。
(2) 細胞密度 - 一部の細胞は過度に濃密に成長できず、適切なタイミングでパージする必要があります；
(3) 剥離が始まった直後に培地を交換して死滅した細胞を洗い流す。死滅した細胞からの物質は大量のアポトーシスを引き起こす可能性がある。
Q20：トリプシン消化時に細胞が丸くなるのはなぜか？
A20：トリプシン消化は、接着性細胞が保護層を失い増殖能が弱くなるため、丸くなります。内部の骨格張力により、細胞は球形になります。長時間のトリプシン曝露も細胞膜タンパク質を消化し、細胞を損傷します。注意深く使用してください。
Q21：実験における細胞凝集をどう解決しますか？
A21：懸濁培養細胞を培養する際、細胞はさまざまな理由から塊状に凝集することがあります。
最も一般的な原因は培地中の自由 DNA と細胞デブリです。これは通常、細胞溶解後に発生します。DNA の粘性により、細胞とデブリが大きな塊として凝集します。
以下に細胞溶解および DNA が培地中に放出される原因を挙げます：
(1) 過消化：トリプシンなどのプロテアーゼによる過度な処理が細胞凝集を引き起こす；
(2) 環境ストレス：機械的な力、繰り返しの冷凍・解冻などによるストレスが細胞死を加速し、細胞接着が早期の症状として現れます；
(3) 組織解離：一次組織から単一細胞懸濁液を調製するために、化学的、機械的、または酵素学的な方法を使用すると一部の細胞が破裂する可能性があります。コラーゲナーゼ消化は通常、細胞外マトリックスを分解するために使用されます；
(4) 過成長：細胞が融合に達すると、細胞デブリと自由 DNA が過度に蓄積します。
Q22：細胞が適切に消化されているかをどう判定しますか？
A22：まず理解してください：適切な消化とは、完全な単一細胞分散を意味するわけではありません。視覚的には、接着性細胞層が剥離し始め、砂粒のように流れるとき、細胞は基質から剥離し、細胞間の結合が切断されています。細胞は独立しているが完全に分散していない - すぐに消化を停止します。
次に注意してください：顕微鏡下ですべて大きな隙間があるように細胞が完全に分離するまで待たないでください。単一細胞懸濁液であっても、細胞は接着時に再凝集します - これは接着性細胞（特に腫瘍細胞）の内在特性です。
最後に考慮してください：異常な細胞形態は不適切な消化を示している可能性があります。ただし、消化が正しいにもかかわらず細胞がシート（層）を形成する場合は（たとえ慎重にピペッティングを行っても）、これは細胞の特性を反映しています - 接着時に再凝集します。均一な分布を強いることは細胞状態を損ないます。
Q23：完全培地交換をどう実施しますか？
A23：接着性細胞の場合、完全培地交換を使用します：古い培地をすべて吸引し、十分な量の新鮮な完全培地を加えます。
完全培地交換手順：
(1) 器具を層流フードに置き、UV 消毒ターンオンします。温度感受性の細胞の場合、血清を含む培地を水浴槽で 37°C に温めてからフードへ転移します。UV で培養室を約 30 分間照射します。
(2) フラスコをインキュベーターから取り出し、表面に 75% エタノールをスプレーして転移します。キャップを開け、古い培地を優しく吸引します。ピペッティング管で新鮮な血清を含む培地を加えます - 細胞層に直接加えないでください。壁に沿って優しく加液して剥離を防ぎます。
(3) フラスコをキャップし、培地交換時間、細胞種、および操作者情報をラベル付けします。
(4) インキュベーターへ戻す前に、フラスコ表面に再びエタノールをスプレーします。フード表面をエタノールで清掃し、廃棄物を処理します。
Q24：部分培地交換をどう実施しますか？
A24：「部分培地交換」とは、古い培地の半分を廃棄し、新鮮な培地の半分を加えることを意味します。部分交換の理由：
(1) 適応のためのバッファ環境を提供します；
(2) 成長中に細胞は成長因子を分泌する可能性があります；
(3) 材料を節約します；
(4) 利便性：例えば、96 ウェルプレートは完全に変更するのが困難です。多チャンネルピペッティング管は部分交換によく使用されます；
(5) 懸濁細胞の場合、部分交換は細胞密度を低下させます；
Q25：懸濁細胞の培地交換をどう実施しますか？
A25：手順：
(1) 古い培地の半分を吸引します；
(2) 新鮮な完全培地を加えます（細胞の半分が失われます）。
細胞を失わないようにするには、培養を遠心管へ転移し、遠心分離して古い培地を除去し、沈降物を新鮮な培地で再懸濁します。
Q26：培地交換中の PBS 洗浄は必要ですか？
A26：私たちが知っています。「接着性細胞のパージ」中に、培地の血清がトリプシン活性を阻害し消化に影響を与えるため、PBS 洗浄は不可欠です。
しかし、培地交換については PBS 洗浄の有無について明確なガイドラインはありません。
細胞固有の条件を考慮してください：
a.デリケートな細胞または不良な成長条件の場合、PBS 洗浄を避けてください。PBS 洗浄は弱い細胞接着を乱し、分泌された成長因子を洗い流す可能性があります。洗浄が必要であれば、優しく行うようにしてください；
b.健康的な細胞、または培地が汚れている場合、PBS 洗浄は蓄積した代謝産物を除去し、悪く成長する/老化した細胞を洗い流してバイアビリティ（生存率）を維持します。
Q27：培地交換时应注意的事项有哪些？
A27：注意事项：
(1) 全程保持无菌：穿戴无菌隔离衣、手套和口罩。小心处理瓶口，避免污染；
(2) 不要将培地直接加到附着细胞上；
(3) 更换培地前观察并拍摄细胞状态。
Q28：血清质量对细胞培养有什么影响？
A28：血清是细胞培养基的关键成分。质量差的血清可能含有有毒物质、微生物污染物，或生长因子含量低，从而影响细胞生长和实验结果。
Q29：如何保存细胞培养基？
A29：将培养基储存在避光的 2-8°C。避免反复冻融循环。制备后过滤除菌并分装保存。含血清的完全培养基应在 2-4 周内使用。
Q30：细胞培养中抗生素的作用是什么？
A30：抗生素用于防止细胞培养中的细菌污染。常用抗生素包括青霉素、链霉素和两性霉素 B。然而，长期使用抗生素可能会掩盖污染并影响细胞代谢。
Q31：如何排查常见的细胞培养问题？
A31：排查步骤：（1）检查培养环境：温度、CO₂浓度、湿度；（2）检查培地：pH、血清质量、营养成分；（3）检查细胞：形态、密度、污染情况；（4）回顾实验操作：无菌技术、试剂处理、孵育条件。系统性的排查有助于识别根本原因。